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昆虫病原真菌

        能侵入昆虫体内寄生、使昆虫发病致死的真菌称为昆虫病原真菌(或虫生真菌)(entomophagous fungus)。昆虫病原真菌是最大的昆虫病原微生物类群,共约750种,寄主范围广泛。用实验手段证明昆虫由微生物感染致病,就是从病原真菌开始的。早在1834年,Bassi实验证明白僵菌使家蚕发生白僵病,标志着人们对昆虫疾病的认识,也奠定了昆虫病理学的基础。系统地利用昆虫病原微生物防治害虫,也以病原真菌最早。

        十九世纪未期,应用真菌防治害虫,曾受到昆虫工作者的重视,一直到二十世纪二十年代,还有不少科学工作者热心于真菌防治害虫的试验,但没有一项获得特别成功。

        第二次世界大战之后,不少科学工作者对于应用真菌防治害虫,深感兴趣。先后利用各种真菌对不同害虫种类进行防治试验,其中不少取得了可喜成绩,中国在50年代后期及60年代,应用白僵菌防治大豆食心虫,松毛虫及玉米螟等,取得了良好效果。

        从20 世纪80年代以来,随着自然因素对害虫种群调节的研究逐渐深入,而真菌引起的流行病在一定场合下能起显著的作用,许多国家竞相开展了昆虫病原真菌的利用研究。

昆虫病原真菌的优点

        目前中国乃至世界范围内研制比较成功的当属生物农药, 其中主要包括微生物农药和植物源农药, 在微生物农药中, 以昆虫病原真菌为主的杀虫剂在昆虫生物防治中起着重要作用, 而昆虫病原真菌的研究也越来越受到人们的广泛关注。

        昆虫病原真菌具有很多优点: (1) 多数种类专化性不强, 寄主范围较广, 能防治多种害虫; (2) 不一定从消化道侵入虫体, 体壁、气孔均可入侵, 增加了感染害虫的机会; (3) 真菌孢子具有较强的抗逆性, 有的可在环境中存活几年, 有的在缺乏寄主时可营腐生生活, 有利于种群的建立和延续; (4) 很多种类容易人工培养, 可进行大量生产乃至工厂化生产; (5) 大多数真菌对人及天敌无害, 商品化生产和注册的种类均已通过了安全性检验, 不污染环境; (6) 在自然环境中可不断增殖, 能长期控制虫害且不易使其产生抗性。此外, 昆虫病原真菌还是昆虫病原物中唯一的能通过表皮感染昆虫的微生物,在害虫生物防治中占有特殊地位。基于上述优点, 昆虫病原真菌具有广阔的开发利用前景。

昆虫病原真菌的分类

        据不完全统计,世界上记载的虫生真菌约100属800多种。在中国已报道的达405种, 其中虫草属80种, 寄生线虫的真菌10种, 寄生昆虫的真菌种类215种, 报道的新种达24种。中国自50年代以来,开发应用的昆虫病原真菌约20种,使用最广的是白僵菌和绿僵菌。

半知菌亚门

        半知菌亚门(Deuteromycotina)属真菌门。因在其生活史中尚未发现有性阶段,仅发现了无性阶段而得名。半知菌亚门真菌的特征是, 营养体为发达的有隔菌丝, 形成子座、菌核, 分生孢子梗;无性繁殖发达且具有经济意义,以芽殖、断裂及裂殖的方式产生分生孢子,它们形成在分生孢子梗上;分生孢子梗 单生、簇生或集结成孢梗束,其内(外)合生或离生产孢细胞,产孢细胞产生形形色色的分生孢子。分生孢子的形态变化很大,可分为单胞、双胞、多胞,砖隔状、线状、螺旋状和星状等7种类型;没有或不常见其有性生殖,但大多可进行准性生殖;若存在有性生殖,产生子囊孢子或担孢子,多属于子囊菌门,少数属担子菌门、接合菌门真菌;繁殖方式主要有两种:(1)生活史中仅有菌丝的生长和增殖,菌丝常形成菌核、菌索。不产生分生孢子。有的种类可形成厚垣孢子。腐生或寄生。(2)绝大多数的半知菌都产生分生孢子:在半知菌的有隔菌丝体上形成分化程度不同的分生孢子梗,梗上形成分生孢子。分生孢子梗丛生或散生。丛生的分生孢子梗可形成束丝和分生孢子座。束丝是一束排列紧密的直立孢子梗,于顶端或侧面产生分生孢子;分生孢子座由许多聚成垫状的短梗组成,顶端产生分生孢子。较高级的半知菌,在分生孢子产生时形成特化结构,由菌丝体形成盘状或球状的分生孢子盘或分生孢子器。分生孢子盘上有成排的短分生孢子梗,顶端产生分生孢子;分生孢子器有孔口,其内形成分生孢子梗,顶端产生分生孢子。分生孢子盘(器)生于基质的表面或埋于基质、子座内,外观上呈黑色小点。
        在昆虫病原真菌的100多个真菌属中,约50多个属于半知菌亚门。其中不仅包括了当今世界上应用于害虫的大多数种,而且涉及了应用于医药方面的虫草无性型(分生孢子阶段),目前已在生产上得到应用的主要有白僵菌、绿僵菌、拟青霉菌、莱氏野村菌(莱氏蛾霉)、汤普森被毛孢、蜡蚧轮枝孢等。

接合菌亚门

        接合菌亚门(Zygomycotina)属真菌门。该亚门菌丝体无隔,少数在幼嫩时产生隔膜,细胞壁由几丁质和壳聚质构成。无性繁殖 在菌丝顶端有多核原生质密集,膨大形成孢子囊;孢子囊可在营养菌丝顶端或分生孢子梗上形成,孢子梗分枝或不分枝。孢子囊内产生大量不动的孢子,称为孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂,孢子随风散布,在适宜条件下再萌发长成菌丝。菌丝发达,多分枝,无横隔,多核。少数种类还可形成虫菌体、节孢子、变形细胞等。有性生殖由相同的或不同的菌丝所产生的两个同形等大或同形不等大的配子囊,经过接合后形成球形或双锥形的接合孢子。
        接合菌亚门虫霉目虫霉科真菌大约有150多种,其中绝大多数对昆虫的寄生性很强,可寄生32个科120多种昆虫,寄主幼虫、蛹、成虫等各个虫态均可感染,是蝗虫、蝇类、蛾类、蚜虫、蚧类及螨类的主要寄生菌。虫霉科中有10多种虫霉如逸孢霉属、虫霉属、疫霉属、新接合霉属和虫疫霉属真菌等都可引起蚜虫30-100%的死亡率。

鞭毛菌亚门

        鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)属真菌门。无性生殖产生具鞭毛的游动孢子。营养体为比较原始的原质团单细胞,不形成菌丝或 菌丝不发达,较高级种类形成无横隔、多核的分枝菌丝。无性生殖在菌丝顶端产生孢子囊,或整个细胞发育为原孢子囊堆,再产生游动孢子。有性生殖低等的种类以游动配子结合,产生合子,发育成休眠孢子囊,大多数以异形配子囊结合产生卵孢子。大多种类水生,少数陆生。
        昆虫病原真菌主要存在于雕蚀菌和链壶菌属,前者已发现了40多个种,均为水生昆虫的专性寄生菌,寄主以蚊科幼虫为主,此外还可侵染半翅目的三星仰泳蝽,双翅目的毛蒙科、摇蚊科、蚋科及虻科等昆虫。链壶菌可以寄生剑水蚤和多种蚊幼虫,对库蚊、伊蚊、按蚊幼虫有很强的毒性。

子囊菌亚门

        子囊菌亚门(Ascomycotina)属真菌门,是真菌门中最大的一亚门。全世界发现子囊菌亚门真菌32000种,占真菌的1/3,都是高等真菌。主要特征是营养体除极少数低等类型为单细胞(如酵母菌)外,均为有隔菌 丝构成的菌丝体。细胞壁由几丁质构成。有性过程中形成子囊,是子囊菌有性过程中进行核配和减数分裂发生的场所,在子囊中产生具有一定数目(多为8个,有的为4个、16个或其他数目)的子囊孢子。无性生殖发达,产生不同类型的分生孢子进行繁殖。水生或陆生。腐生在多种多样的基物上或寄生在很多种的动植物上,也有许多子囊菌可与藻类共生形成地衣。
        子囊菌亚门虫草属,分布于全世界,已发现报道的有350多种,通常可侵染半翅目、等翅目、直翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫,有的种还可以寄生于蜘蛛和其他丝状菌的菌核及子实体。

重要的昆虫病原真菌

        (1) 白僵菌       白僵菌是发展历史较早、普及面积大、应用最广的一种昆虫病原真菌,属半知菌类,主要用于防治玉米螟和松毛虫,其寄主种类达15个目149个科521个属707个种,还可寄生13种螨类。白僵菌不仅田间残效长,而且在越冬期仍有36-55%幼虫被寄生,以致来年不能羽化。连年使用可大大降低虫量,这是其它药剂所不能比拟的。据资料报道,在前苏联主要用白僵菌防治马铃薯甲虫,美国用于防治森林害虫,而中国用它防治的害虫种类达40种以上,其防效在80%以上。
        研究表明,0-10℃自然变温下,白僵菌孢子不萌发侵染(林华峰等,1999)并且寄主有一定免疫防御能力,尤其在低温环境中更易显现(林华峰,1998)。中国马尾松毛虫2-3代区,冬春RH<85%,过去提倡的冬前或冬季施用白僵菌是不适宜的,主张一般年份在6月份放菌防治第一代幼虫(林华峰等,1998)。只有在18-24℃、RH>90%温湿双因子共存时才有白僵病的流行(梁修山等,1999)。

        (2) 绿僵菌       绿僵菌是最早用于防治农业害虫的真菌,属于半知菌类,能寄生昆虫的8个目,30个科约200多种,也能寄生螨类,可诱发昆虫产生绿僵病。目前,中国已有绿僵菌杀虫剂工业化生产,产品产孢量50亿个/g, 萌发率91%。用含孢量2亿/ml绿僵菌粉防治杨天牛,防效可达70%以上。中国农科院生防所用绿僵菌防治东亚飞蝗,室内处理后第10d死亡率为100%,并在1995年进行了田间试验,取得了较好效果,初步证明应用绿僵菌防治东亚飞蝗有很好的前景。









        (3) 拟青霉       中国大田应用的拟青霉主要有淡紫拟青霉、粉质拟青霉和肉色拟青霉等。淡紫拟青霉主要用于防治大豆胞囊线虫和烟草根结线虫,其杀虫活性较高,发酵液有类似细胞分裂素的作用,可促进作物生长。目前,中国已进行工业化液体发酵生产,主要用于防治大豆胞囊线虫病,防效在60%以上。

        (4) 曲霉属       曲霉属是一类分布广泛的真菌,它能生活在各种基物上,其中有一些种类与昆虫有密切的关系。已报道的可寄生昆虫的曲霉菌资源有黄曲霉、黑曲霉、亮白曲霉、青霉状曲霉、日本曲霉、寄生曲霉、白曲霉、灰绿曲霉和四脊裸胞壳等。其中,黄曲霉寄生甘蔗白螟,自然寄生率为6-8%,人工感染致死率达70-75%; 四脊裸胞壳对蚜虫有很高的寄生率。

        (5) 座壳孢菌       双座壳孢菌可防治剌棉蚧;柑桔粉虱座壳孢可防治粉虱和剌长粉虱;乳突座壳孢可防治温室白粉虱。福建省高日霞将有粉虱座壳孢子座的柑桔枝叶挂在桔园中,防治柑桔粉虱寄生率达70-90%。

        (6) 多毛菌       汤氏多毛菌对柑桔锈瘿螨、柑桔锈壁虱、柑桔全瓜螨都可长时期起控制作用。浙江省用其防治柑桔锈壁虱和粉虱,防效可达70-90%。

        (7) 虫霉       使用虫霉防治害虫成功例子较少,但在自然条件下虫霉可以引起害虫流行病大发生,所以研究虫霉将有很重要的现实意义。虽然虫霉离大田使用还有一定的距离,但其在菌丝生产方面,李增智等成功地实现了新蚜沥霉和根虫瘟霉的干菌丝生产,为虫霉的今后使用奠定了基础。

        (8) 镰刀菌       串珠镰刀菌可寄生甘蔗蚜虫。每年的高温多雨季节,此菌常造成甘蔗蚜虫的大量死亡,虫尸僵硬,互相连结形成白色团块。自然致病率为30%左右,人工感染致死率为60-65%。串珠镰刀菌亚胶孢变种寄生甘蔗条螟,寄主虫尸僵硬,头部和胸腹两侧略有白色茸毛状物,自然致病率为3-5%,人工感染致死率为50-60%。

昆虫病原真菌的致病机理

        昆虫病原真菌的致病机理一直是研究热点, 真菌感染昆虫不仅受到本身专化性、感染发生数量和寄主的生理状况影响, 而且与环境条件密切相关, 特别是温度、湿度、光照等因素。通过实验, 可人工模拟各种环境因子, 分析各类因子与浸染和治病的关系。近年使用的荧光显微技术及切片染色技术使得不但可检测寄主体表侵入体的侵入过程, 还可检测寄主昆虫体内的菌体发展进程及寄主生理变化。电镜扫描技术也可帮助观察侵入体内寄主表皮的机构变化。

        昆虫病原真菌从孢子萌发开始侵染到菌体重新在虫体上产生孢子的过程,一般分为10个阶段:(1)孢子附着于寄主表皮; (2)孢子萌发;(3)穿透表皮;(4)菌丝在血腔内生长;(5)毒素产生;(6)寄主死亡;(7)菌丝侵入寄主的所有器官;(8)菌丝穿出表皮;(9)产生孢子;(10)侵染单位的扩散。只要完成了前四个阶段,就完成了对寄主的入侵和感染; 当病原真菌在体内的菌丝大量增殖时,就可导致寄主死亡。

附着胞的形成

        和许多植物致病真菌一样,昆虫病原真菌的孢子在宿主的体表经常分化出附着胞。其功能就是提供机械压力和分解体壁的降解酶,帮助侵染钉穿透昆虫体壁。在金龟子绿僵菌、球孢白僵菌等大多昆虫病原真菌中,附着胞的产生对于建立病原与寄主之间的关系是至关重要的。胞内第二信使Ca2+和环腺苷酸(cAMP)参与附着胞的形成。已经从金龟子绿僵菌中鉴定出来这些信号转换路径的一些成分。Leger等提出,附着胞的形成与Ca2+浓度梯度被破坏从而激活一种离子通道相关。附着胞形成时,cAMP水平会大幅度地上升。已经从金龟子绿僵菌中鉴定出来一种依赖cAMP的蛋白质激酶(PKA)的调节亚基,添加PKA抑制剂HS会选择性地抑制附着胞的形成。同样在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr) 中证实了离体条件下cAMP在附着胞发育中的作用。目前已经从Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr中克隆出了PKA基因,破坏这一基因会特异性地阻止附着胞的形成,但对菌丝生长,和产孢的有性生殖没有影响。附着胞的形成可能还有一些其它可能的信号传导途径,例如昆虫病原真菌与植物和动物的病原真菌一样,都可能存在促进分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径。另外,在植物病原真菌中,巯水蛋白对附着胞的形成也有较大的影响。巯水蛋白被破坏的稻瘟病菌菌株的附着胞形成的效率和毒力都降低。目前,在金龟子绿僵菌中克隆了有巯水蛋白的ssgA基因,但它的功能仍有待研究。

分解寄主外壳的水解酶

        昆虫病原真菌通过机械压力和水解酶的水解作用穿透昆虫体壁。相对昆虫体壁的组成成分,病原真菌产生的水解酶有几丁质酶、蛋白酶和脂酶等。目前,对蛋白酶作用的研究较清楚,对脂酶的作用了解还不多。

        (1) 蛋白质降解酶       在附着胞和以昆虫体壁为唯一碳氮源的诱导培养基中有多种蛋白酶的表达,这些蛋白酶可分为两大类:一类是对底物短肽Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Nz具有活性,包括PR1(类枯草杆菌蛋白酶);另一类是对短肽Ben-Phe-Val-Arg-Na有活性的蛋白酶,包括PR2(胰蛋白酶)。用组织免疫定位法证明,PR1类蛋白酶是在附着胞和穿透寄主体壁早期就有高水平的表达,其在侵染2h后大量产生,与昆虫体壁接触后,在24h内它的表达提高10倍左右,60h后由菌丝附近向周围扩散。证明PR1类蛋白酶在昆虫病原真菌致病寄生过程中起重要作用的直接证据是对PR1a基因的破坏和超量表达实验。PR1a基因被破坏的金龟子绿僵菌毒力有下降现象, 由于在这个突变体中同时有PR1a的同工酶PR1b和一个金属蛋白酶高水平表达, 使得毒力下降不明显。但是, PR1a高效表达的金龟子绿僵菌菌株的毒力明显提高,杀虫时间缩短了25%,作物损失减少了40%。同时证明PR1a基因是一个致病因子,昆虫血淋巴中高浓度的PR1a蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度表达,导致昆虫中毒死亡。同时由于在血腔中,高水平表达的PR1a降解了寄主的免疫蛋白和脱毒蛋白,降低了寄主的免疫能力从而使击倒昆虫的时间缩短,这就使得人们将PR1a用于植物抗虫育种和PR1a基因导入昆虫病毒中以提高其杀虫速度。PR1类蛋白酶在其它昆虫病原真菌中也存在,如在黄色曲霉(Aspergillus flavus Link)和蜡蛤轮枝菌(Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas) 检测到了此物质。

        (2) 几丁质酶       几丁质占昆虫体壁干重的17-50%左右,是抵御外来入侵的主要屏障之一。用几丁质酶处理烟草夜蛾,阻止其几丁质的合成,然后用金龟子绿僵菌感染这种昆虫。结果发现,几丁质合成受阻的幼虫体壁很容易被昆虫病原真菌降解。因此,几丁质酶很可能也是昆虫病原真菌的一个重要毒力因子。几丁质酶也是诱导酶,昆虫病原真菌在以体壁为唯一碳氮源的培养基和侵染昆虫体壁的后期产生。几丁质酶基因在昆虫病原真菌侵染寄主过程的后期表达,它们在侵染过程中与蛋白酶等协同作用降解昆虫体壁。

毒素的作用

        大多病原真菌毒素的作用是通过抑制血细胞的扩散,降低有粒细胞的数目和浆细胞的循环来削弱寄主的细胞免疫,另外一些是通过次生代谢产物来破坏寄主和生理活动。因此,毒素与昆虫病原真菌毒力密切相关。毒素主要有白僵菌素、环孢素和破坏素3种,其中破坏素的作用正受到广泛的关注。破坏素是由6个氨基酸残基通过酯键首尾相连形成的环肽,环外加上羟基酸的类型和氨基酸残基甲基化的数目,破坏素可分为19类。许多破坏素的作用是影响寄主免疫细胞的活动,它们可能通过改变细胞的Ca2+平衡和细胞内高分子蛋白的磷酸化来影响细胞免疫系统。在发生真菌病的过程中,破坏素影响吞噬细胞的活力、细胞附着和扩散以及浆细胞的细胞骨架的形成。破坏素还可以激活鳞翅目昆虫肌肉细胞的Ca2+通道,引起昆虫麻痹而死。有实验证明,破坏素可以引起昆虫细胞的程序性死亡,以减弱寄主的免疫能力; 另外一些破坏素可以影响寄主的生理活动; 还有一些破坏素可以影响寄主蜕皮激素的合成。

        昆虫病原真菌的作用机制,主要有以下几种:(1) 抑制昆虫的细胞免疫反应:主要通过降低吞噬性血细胞的数量;改变浆细胞的形态和结构,诱导其程序性死亡;降低浆细胞的吞噬活性,抑制包囊化形成;(2) 引起体液免疫中酚氧化酶活性的改变;(3) 使昆虫体壁肌肉细胞发生僵直;(4) 抑制马氏管的分泌和中肠的正常功能;(5) 抑制蜕皮甾类激素的分泌和转运;(6) 对脂肪体和体壁皮细胞层的影响。

        由于虫生真菌对昆虫有极高的感染专一性,很多对杀虫晶体蛋白没有作用的昆虫,虫生真菌可对其产生毒害作用,因此是杀虫晶体蛋白的一种互补性代用品。

昆虫病原真菌的应用

        中国应用白僵菌防治马尾松毛虫已有30年的历史,浙江用高孢粉(1600-2100亿/g)1kg/ha使松毛虫死亡率达80-92%(吴正东等,1994);湖南从1985年起连续8年施用白僵菌79吨,防治松毛虫4.3ha,致死率>85%(黄向东等,2000)。近年来扩大应用范围,防治多种林业害虫都已取得较好防效,如在广东用白僵菌(星天牛菌株)粘、膏、涂孔法防治木麻黄的星天牛,20天后死亡率达70%,30天后达100%(五素草等,2000),但安徽由蛀孔注射菌防治松祸天牛的僵虫,死亡率达10.5-18.3%(孙继美等,1997)。在云南防治松针斑蛾(Elerusia lcptalina),幼虫、蛹总僵死率78.6-88.1%(李学萍,1998),东北在土壤施用白僵菌防治落叶松球果花蝇(Strobilimyica spp),死亡率64.7-81.1%(阎峻等,1995)。但防治落叶松叶蜂效果仅28-52%(周淑芷等,1994)。安徽用白僵菌喷雾防治一字竹象(Otidognathrs davidis Fair.),效果达72.2%(将德冀等,1994)。江西在5月20℃、RH>90%竹蝗1龄盛期施放白僵菌,跳蝻死亡率达80%以上(黄烈燕,1994)。随着中国白僵菌系列产品的发展,将会在林虫防治上发挥更大的作用。广东应用蜡蚧轮枝菌防治大发生的湿地松粉蚧(Oracella acula (Lobdell)Ferris)取得显著防效,林地用16.5×1012及33×1012孢子/ha,死亡率达92.7%及99.5%(潘务耀等,1994;殷风鸣等,1994),是昆虫病原真菌在林虫防治上的又一资源。

        真菌杀虫剂除单独使用外,还可以与其他害虫防治措施联合作用,如与化学农药的配合、其他昆虫病原微生物的配合、与天敌昆虫的配合、与农业栽培措施的配合,在害虫防治起到更大的作用。

        昆虫病原真菌因其遗传背景复杂、杀虫分子机理和遗传改良的研究较昆虫病原细菌和病毒相对滞后。值得一提的是,这方面的研究已有显著进展,如Leger等已从绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中分离出一种类似枯草杆菌素的蛋白酶,在工程菌中高表达后使烟草天蛾的食量减少了40%,死亡时间加快一倍以上。

相关资源:
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http://www.keyunnpv.com/bencandy.php?fid=5&id=200
http://www.sinogaf.com/showteam.asp?id=94&om=8&i=1
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